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FT_FLEISCHEREI_TECHNIK_05_2012

Messtechnik & Prozesskontrolle Measurement & Process Control wird in der Regel von 1 ml Pro- the RNA is available in a volu- be die Gesamt-RNA isoliert. me of 50 l of which however on- Diese RNA liegt letztendlich in Mikrofluidisches System ly 5 l are suitable for hybridiza- einem Volumen von 50 µl vor, microfluid system tion in the biochip. This means von dem jedoch nur 5 µl für die Signal - that the detection limit of the Hybridisierung im Biochip ver- auslesung biochip including RNA isolation wendet werden. Somit liegt die Biologischer Rezeptor Transducer signal read- is approx. 5,000 CFU E. coli perbiological receptor Nachweisgrenze des Biochips out 1ml sample. inklusive des RNA-Isolierungs- schrittes bei etwa 5.000 KbE Isolation of the target RNA E. coli pro 1 ml Probe. Analyt / Analyt Several commercially availa- ble test kits for RNA isolation Die Isolierung der Ziel-RNA have been tested and compa- Für die RNA-Isolierung aus Probenmatrix / matrix of samples red. RNeasy-Kit (Qiagen), E. coli wurden verschiedene RNAqueous-Kit (Ambion), Pre- kommerziell erhältliche Test- stospinR Bug-Kit (Molzym) and kits verwendet und verglichen. Abb. 1: Prinzipieller Aufbau eines Biosensors. Der biologische Rezeptor a ß-version of a Nexttec RNA- Überprüft wurden der RNeasy- selektiert die Analyten und der Transducer wandelt die Reaktionen in Kit were compared. The sam- Kit (Qiagen), RNAqueous-Kit messbare Signale um./ Image 1: Basic design of a biosensor. The biologi- ples were prepared according (Ambion), PrestospinR Bug-Kit cal receptor selects the analytes and the transducer transforms the to the manufacturers specifica- reactions into measurable signals. (Molzym) und eine ß-Version tions. In all cases this involved eines Nexttec RNA-Kits. Die the process of lysis. The RNea- Aufarbeitung der Proben er- sy-Kit delivered the highest to- folgte nach den Angaben der somen. Nahe der exponen- biological E. coli germ load and tal RNA yield both from meat Hersteller, die in jedem Fall ei- tiellen Wachstumsphase, bei the biochip signal with a detec- juice only and from meat juice nen Lysozymverdau beinhalte- einer Generationszeit von tion limit of 500 CFU (colony inoculated with E. coli. The ten. Mit dem RNeasy-Kit wur- 24 min hingegen sind mit 7,2 x forming units). This detection li- yield could be increased by ad- den dabei die höchsten Ge- 104 Ribosomen je Bakterium mit refers to the total RNA ditional digestion with Pro- samt-RNA-Ausbeuten sowohl das ca. Zehnfache an Riboso- quantity, which was used for teinase K. For the disruption of im Fleischtropfsaft allein, als men – und damit des Ziel- hybridization in the biochip. bacteria an additional ultraso- auch im Fleischtropfsaft, der moleküls 16S rRNA – enthal- If RNA isolation is included, und treatment device was inte- mit E. coli inokuliert wurde, er- ten. Dies bedeutet für den the total RNA can be isolated grated in the system, since this halten. Erhöht werden konnten 16S rRNA-Direktnachweis ei- from a sample of 1ml. As a result three-step lysis (Lysozym + die Ausbeuten durch einen zu- Proteinase K + ultrasound tre- sätzlichen Proteinase-K-Ver- atment) provided the best re- dau. Für den Aufschluss der sults. Bakterien wurde zudem eine Vier-Komponenten-Sandwich Hybridisierung Despite an efficient RNA Ultraschallbehandlung in das four-component-sandwich-hybridization yield provided by three-step ly- System integriert, da mit dieser sis, it was necessary to increase „Dreischritt-Lyse“ (Lysozym + the samples concentration for a Proteinase K + Ultraschall) die Detektor-ODN mit Reporterenzym (Thermostabi- short time both in order to opti- besten Ausbeuten erzielt wer- le Esterase2) / detector-ODN with reporter enzy- pAPB mize the entire procedure and den konnten. me (thermostable esterase2) Trotz einer effizienten RNA- Lyse-Schritt war es sowohl für helper-ODN NH2 E.coli-16 rRNA durch Vier-Kompo-Abb. 2: Spezifischer Nachweis vonAnalytAnalyt /Helfer-ODN Ausbeute durch den Dreifach- die Optimierung des gesamten H2 H nenten-Hybridisierung und ansch- Verfahrens als auch für eine catcher-ODN Redox-Recycling ließender elektrochemischer Detek-HFänger-ODN / Steigerung der Nachweisemp- +2H+ -2H+ tion mittels Biochip (modifiziert findlichkeit erforderlich, das +2e -2e nach Pöhlmann, 2009). / Probenmaterial kurzzeitig an- chip surface Image 2: Specific proof of E.coli-16Chip-Oberfläche zureichern. rRNA by Vier-Komponenten-Hybri- sich der Ribosomengehalt hydrolytische Spaltung zum elektro- hydrolytic separation into the electri- Grafiken: Gareis/Max-Rubner-Institutcal Detektion by means of biochipAfter the addition of the electrically in-active substrate p-aminophenylbutyra-te (pAPB) the esterase catalyzes theElektochemische Detektionelectochemical detektionmarkingNach Zugabe des elektoinaktivenSubstrates p-Aminophenylbutyrat(pAPB) katalysiert die Esterase dieMarkierung mit Enzym-konjugat /wirh enzyme conjugateBindung der gesuchten 16S rRNAbinding of relevant 16S rRNAHierfür wurden folgendedisierung and next electro-chemi- Überlegungen zugrunde ge- legt: Der Ribosomengehalt von Bakterien hängt von deren physiologischem Zustand ab. Für E. coli wurde gezeigt, dass in Abhängigkeit der Genera- aktiven p-Aminophenol (pAP). Diese cally active p-aminophenol (pAP). This tionszeit erheblich unterschei- durchläuft einen Reddox-Recycling- runs through a reddox-recycling pro- det. Bei einer Generationszeit data analysis Prozess, in Folge dessen je Zyklus 2 cess, in the course of which two elec-Datenauswertung von 100 min enthält eine Elektronen generiertund amperome- trons a cycle are generated and am- E. coli-Zelle ca. 6,8 x 103 Ribo- trisch erfasst werden perometrically detected. 54 5/2012


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